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1引言
隨著人們對健康環(huán)保紡織品需求的增加以及各國政府對環(huán)境保護(hù)強(qiáng)制力度的加大,在紡織印染行業(yè)中一種新型的紡織助劑———生物酶制劑的應(yīng)用逐漸發(fā)展起來。目前,一種基于果膠酶的新型紡織生物助劑正在應(yīng)用推廣中,它主要用于棉、麻的前處理工藝。由于紡織企業(yè)多數(shù)對果膠酶的生物特性不甚了解,在工藝應(yīng)用過程中缺乏相應(yīng)的檢測手段,使其推廣受到限制。酶活力(活性)是衡量酶生物活性及含量的重要指標(biāo),因此,建立適用于紡織行業(yè)的果膠酶酶活檢測方法,是十分迫切和必要的。
2果膠酶的酶促作用機(jī)理
果膠酶是一類復(fù)合酶,是指分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱。我們測定的酶活值通常是這一類復(fù)合酶協(xié)同作用的綜合結(jié)果。果膠酶可分為兩大類:解聚酶和果膠酯酶。解聚酶主要是通過水解作用和反式消去作用,切斷果膠和果膠酶分子α-1,4糖苷鍵,將果膠分子降解為小分子。果膠酯酶的作用是使果膠分子中的甲酯水解,最后形成果膠酸。
果膠質(zhì)主要是由Ｄ-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵連接形成的直鏈狀聚合物。部分Ｄ-半乳糖醛酸上的羧基被甲醇酯化、形成甲酯,或被一種或多種堿部分或全部中和。果膠質(zhì)在植物的細(xì)胞組織中起著“粘合”作用,在棉纖維的初生胞壁中,果膠質(zhì)含量約占9%,而麻纖維則更高。
通過果膠酶的作用,將果膠質(zhì)降解為小分子物質(zhì),從纖維中游離出來,可使與其粘合在一起的其它雜質(zhì)(如蠟質(zhì)、蛋白質(zhì)、灰份等)與纖維素徹底分開,達(dá)到棉精煉或麻脫膠的目的。
對于紡織行業(yè),需要的是將果膠催化水解成可游離出纖維的、小分子物質(zhì)的果膠酶活性(力),因此,主要測定解聚酶的活力。解聚酶對果膠分子的酶促催化作用表現(xiàn)為,每切斷一個(gè)果膠分子的α-1,4糖苷鍵,就會(huì)形成一個(gè)還原性醛基。通過測定這些還原性醛基生成的量,即可判定解聚酶的酶活力。
3測定酶活力(性)的基本原理
酶作為一種生物催化劑,其酶活力值是與其催化效率及有效(即有生物活性)酶的含量相關(guān)的。酶活力是酶在單位時(shí)間內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化為反應(yīng)產(chǎn)物的
根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的米氏學(xué)說,從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā),按照“穩(wěn)態(tài)平衡”假說的設(shè)想,可推導(dǎo)出如下公式:
產(chǎn)物生成速率=ｋ3[總酶][底物]/([底物]+ｋｍ)(1)
式中:[總酶]———酶的總濃度(ｍｏｌ/ｍＬ);
[底物]———底物濃度(ｍｏｌ/ｍＬ);
ｋ3———在酶促反應(yīng)的第二步,形成最終產(chǎn)物的速率常數(shù);
ｋｍ———米氏常數(shù)(ｍｏｌ/ｍＬ),其值是當(dāng)酶反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度。
要估計(jì)[總酶],首先要固定所有可控制的獨(dú)立變量,如ｐＨ值、溫度等。
當(dāng)[底物]>>Ｋｍ時(shí),底物對反應(yīng)速率的影響可忽略(酶飽和),酶促反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速率Ｖｍａｘ,其結(jié)果是:
產(chǎn)物生成速率=ｋ3[總酶]=Ｖｍａｘ=Ｕ
Ｕ就成為總酶量的一種測量。因此,可以通過測定Ｕ來反映酶制劑中有效酶蛋白的含量。
4果膠酶酶活的測定方法概述和比較
測定果膠酶酶活的方法有很多,但基本上都是利用酶促分解果膠產(chǎn)生的粘度下降或生成的還原性醛基來測定果膠酶酶活。這些方法概括起來主要有粘度降低法、滴定法和分光光度法3種。本文分別選取一種較典型的測定方法加以介紹。
4.1粘度降低法
4.1.1原理
果膠溶于水后形成粘稠狀溶液,其粘度和溶解度與其聚合和酯化程度有關(guān)?？梢岳霉z的這種性質(zhì),測其酶活力。即在一定溫度、酶濃度下和一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi),測定標(biāo)準(zhǔn)果膠溶液粘度的降低率。
4.1.2操作方法
浴中保溫10ｍｉｎ后,加入1ｍＬ酶液,繼續(xù)保溫,在不同時(shí)間分別測定反應(yīng)混合液流出粘度計(jì)小球的時(shí)間。對照實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)熱處理已失活的酶液。
4.1.3計(jì)算
粘度下降百分?jǐn)?shù)可用下式表示:
粘度
式中:Ｔ、Ｔｏ和Ｔα分別為反應(yīng)混合液、對照混合液和緩沖液的流出時(shí)間(ｓ)。
酶溶液要預(yù)先稀釋,使粘度降低范圍在20%～80%。在此范圍內(nèi),酶濃度對數(shù)與粘度降低率成正比。以酶作用時(shí)間為橫坐標(biāo)、粘度下降百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,在圖中查出粘度下降50%時(shí)對應(yīng)酶的作用時(shí)間(Ｔ1/2)。在上述條件下,引起粘度下降50%的酶量為10個(gè)果膠酶活力單位,即酶活單位=10/(Ｔ1/2/3600)。
4.2滴定法
4.2.1原理
果膠酶徹底水解果膠,生成半乳糖醛酸;半乳糖醛酸可與碘(過量)反應(yīng)。反應(yīng)后剩余的碘可用硫代硫酸鈉溶液滴定,據(jù)此可得出酶解反應(yīng)產(chǎn)生的半乳糖醛酸的量。以生成半乳糖醛酸的量衡量果膠酶的活力。
4.2.2測定方法
取1%果膠溶液10ｍＬ,加入到5ｍＬ酶液和5ｍＬ水,調(diào)ｐＨ至3.5,在50℃水浴中保持2ｈ,取出加熱煮沸。冷卻后,取5ｍＬ反應(yīng)液移入碘量瓶中,加1Ｍ碳酸鈉溶液1ｍＬ,0.1Ｎ碘液5ｍＬ,搖勻,加塞,于室溫下放置20ｍｉｎ,加2Ｎ硫酸2ｍＬ,用0.05Ｎ硫代硫酸鈉滴定至淡黃色,加0.5%淀粉指示劑1ｍＬ,繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為止。記錄所消耗的硫代硫酸鈉毫升數(shù)Ａ?？瞻自囼?yàn)用10ｍＬ果膠溶液、10ｍＬ水,不加酶液,不經(jīng)保溫,直接取此混合物5ｍＬ于100ｍＬ三角瓶中用于滴定,記錄消耗的硫代硫酸鈉毫升數(shù)Ｂ。
4.2.3計(jì)算
在上述條件下,1ｈ酶促轉(zhuǎn)化果膠、生成1ｍｇ當(dāng)量游離半乳糖醛酸所需的酶量定為一個(gè)酶活單位。
每毫升酶液的活力單位=(Ｂ-Ａ)Ｎ×0.51×20.(5×2×5)(3)
式中:Ｎ———硫代硫酸鈉的當(dāng)量濃度;
0.51———1ｍｇ當(dāng)量硫代硫酸鈉相當(dāng)于0.51ｍｇ當(dāng)量的半乳糖醛酸;
20———分解果膠反應(yīng)液的總體積數(shù);
5、2、5———分別表示反應(yīng)中加入酶液的毫升數(shù)、反應(yīng)時(shí)間、滴定時(shí)所取反應(yīng)液的毫升數(shù)。
4.3分光光度法
4.3.1原理
果膠酶分解
4.3.2操作方法
取0.5%果膠溶液0.5ｍＬ加入到0.5ｍＬ酶液中,搖勻。在50℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)0.5ｈ,取出后,迅速在沸水浴中加熱5ｍｉｎ,冷卻。取0.5ｍＬ反應(yīng)液移入加有0.5ｍＬＤＮＳ試劑的試管,加4ｍＬ蒸餾水,搖勻,在沸水浴中加熱5ｍｉｎ,迅速冷卻。用分光光度計(jì)在540ｎｍ處測其吸光度值。參比液配制:加熱滅活5ｍｉｎ的0.5ｍＬ的稀釋酶液與0.5ｍＬ0.5%果膠溶液充分混合。
4.3.3計(jì)算
采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法,配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,在540ｎｍ處測定吸光度(Ａ),以葡萄糖濃度(Ｃ)為橫坐標(biāo)、吸光度(Ａ)為縱光標(biāo)作Ａ.Ｃ標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見5.2節(jié)圖2)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得公式:
Ａ=斜率×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)(4)
未知試液測定吸光度值Ａ后,可通過上式求得Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)。
在上述條件下,每小時(shí)內(nèi)每毫升果膠酶酶促轉(zhuǎn)化果膠生成1ｍｇ當(dāng)量還原糖(以半乳糖醛酸計(jì))所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。即:
果膠酶活(ｍｇ半乳糖醛酸/ｍＬ·ｈ)=酶液稀釋倍數(shù)×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)×2×194/180(5)
式中:194/180———葡萄糖換算成半乳糖醛酸的量;
2———測定中稀酶液被0.5%果膠溶液稀釋的倍數(shù)。
4.43種方法的比較
將粘度降低法用來測定果膠酶的復(fù)合酶活力比較準(zhǔn)確,但操作過程也相對復(fù)雜,且測定靈敏度不高。滴定法設(shè)備使用簡單,測試重現(xiàn)行好,準(zhǔn)確度高,但測定時(shí)間長,過程較繁瑣,試劑用量較大。而分光光度法測定的靈敏度、準(zhǔn)確度均高,重現(xiàn)性好,試劑用量少,尤其是操作省時(shí)、簡便。對于上述3種測定方法,根據(jù)紡織行業(yè)的特點(diǎn),筆者認(rèn)為分光光度法更適于紡織工作者應(yīng)用。下面重點(diǎn)探
5應(yīng)用ＤＮＳ比色法測定果膠酶酶活
5.1果膠溶液的配制以及酶液的稀釋
果膠溶液的配制濃度以及酶液的稀釋倍數(shù)是相互聯(lián)系的兩個(gè)數(shù)據(jù),它們的確定對酶活測定結(jié)果的正確性起著關(guān)鍵作用。通過完成以下試驗(yàn),可以確定有關(guān)參數(shù)條件。
5.1.1材料與方法
5.1.1.1儀器與試劑
ＵＶ—9200分光光度計(jì);果膠(Ｓｉｇｍａ)、果膠酶制劑(ＮＯＶＯ)、3,5-二硝基水楊酸、巴比妥酸、巴比妥鈉。
5.1.1.2溶液配制
ＤＮＳ試劑:將6.3ｇ3,5-二硝基水楊酸、262ｍＬ2ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ加到500ｍＬ含182ｇ酒石酸鈉的熱水溶液中,再加5ｇ苯酚及5ｇ亞硫酸鈉,待溶解、冷卻后,加蒸餾水定容至1000ｍＬ,貯于棕色瓶中,一周后即可使用。
5.1.1.3配制巴比妥緩沖液(ｐＨ=8.6)
稱取1.84ｇ巴比妥酸,置于56～60℃水中溶化,然后加入10.3ｇ巴比妥鈉,加蒸餾水定容至1000ｍＬ。
5.1.1.4配制0.5%果膠溶液
準(zhǔn)確稱取0.5ｇ果膠于燒杯中,用巴比妥緩沖液(ｐＨ=8.6)溶解、稀釋定容至100ｍＬ。
5.1.2制作果膠酶稀釋倍數(shù)與吸光度關(guān)系曲線
分別按表1的稀釋倍數(shù)用蒸餾水稀釋果膠酶,將稀釋酶液按4.3.2測定吸光度值,以果膠酶稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度(Ａ)為縱坐標(biāo)作關(guān)系曲線(見圖1)。
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